Fondata unitamente al Museo e all’Archivio nella metà dell’Ottocento, vanta raccolte che ammontano a più di 500.000 volumi; il patrimonio storico è costituito principalmente di fondi manoscritti e antiquari, provenienti in larga misura da biblioteche private di famiglie e collezionisti padovani dell'Ottocento e del Novecento. E' pertanto la biblioteca cittadina la custode del patrimonio storico, letterario e artistico di Padova.
Fra i codici riccamente miniati, il Capodilista del 1434, ci dà notizie sulle origini delle famiglie Forzaté e Capodilista, esaltandone la magnificenza con grandi miniature a piena pagina; il Liber de princibus Carrariensibus, del secolo XV dell’umanista Pietro Paolo Vergerio, è una silloge delle biografie dei principi Carraresi, impreziosito dai ritratti miniati a figura intera dei principi. Il De anima di Aristotele, stampato a Padova nel 1471, fregiato di una bella iniziale miniata che raffigura il "princeps philosophorum" è invece il primo libro, datato con sicurezza, del prototipografo - oltre che pittore e intarsiatore - Lorenzo Canozi. La Civica possiede un esemplare della prima edizione stampata da Aldo Manuzio, il più geniale editore-tipografo del Cinquecento, delle Rime di Francesco Petrarca, del 1501: per la prima volta per un testo volgare si utilizza il carattere corsivo italico e il formato piccolo "da mano".
Interessanti sono poi i manoscritti autografi fra cui lettere dei poeti-scrittori Aleardo Aleardi e Giuseppe Baretti e del celebre scultore Antonio Canova. Considerevole anche la sezione dei periodici: 400 correnti e oltre 2.000 cessati. Fra questi figurano numerosi e importanti periodici italiani dell’antico regime, molti dei quali stampati negli stati veneti, comprensivi di gazzette e almanacchi. Di interesse locale: "L’Aurora. Padova", "Il Bacchiglione", "Il Comune: giornale di Padova", "L’Euganeo", "Gazzetta privilegiata di Venezia", "Il Veneto". La Biblioteca custodisce inoltre importanti archivi privati e una cospicua raccolta di iconografia locale.
La biblioteca Civica si articola in due sezioni:
una Sezione storica
per la consultazione del materiale antico, raro e di pregio e gli archivi
una Sezione moderna
con i libri più recenti disposti a scaffale aperto.